核酸提取与纯化

一、核酸提取与纯化介绍

核酸提取是分子生物学的基本组成部分，因高质量的核酸是分子生物学上的应用至关重要。

我们将会总结一些现用核酸提取技术和针对样品类型选择正确提取方法的小建议；也会提及评估核酸浓度和质量，以及核酸提取过程中的常见问题。

a. 为什么需要核酸提取？

核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案（例如：克隆、qRT-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术），获得的核酸可以多种方式进行应用。

准确的研究目的，决定了要提取的核酸类型；核酸的应用往往影响提取方法的选择。（例如：标准的End-point PCR反应，不需要与全基因组测序实验相同的DNA质量）

为了确定研究方法，有必要清楚了解核酸的下游应用以及任何与样品类型相关的潜在限制。（例如，临床样品采集量往往有限，核酸提取存在挑战。）

虽然依据样品类型，细胞裂解方式不同，但整体的核酸提取核心原则不变：细胞或组织样品裂解，去除非核酸污染物（例如，蛋白质等）。

提取核酸的原因：

①为了分析基础研究和疾病研究中的基因表达；

②跟踪对药物治疗的反应（例如，在抗病毒治疗期间和之后监测病毒滴度）。

③识别新物种并深入了解进化过程（例如，Ancient DNA分析）。

④对人类、动物和植物中引起传染病暴发的病原体进行监测和分类。

⑤通过微生物检测和量化监测食品和水安全。

⑥诊断疾病（如基因疾病，癌症，免疫学缺陷）。

b. 细胞裂解的方法

细胞裂解在很大程度上取决于样品类型，更坚固的组织，如植物，与哺乳动物相比则需要更大的力量进行处理。

细胞裂解方法分为三大类：机械裂解、酶裂解和化学裂解。

这个三种分析方法的基本原理和每种方法的优缺点如下：

方法一：机械裂解

机械裂解：细胞膜被外力破坏。

优势：

效率高，速度快；

快速裂解缩短了从采集样本到分离核酸的时间，这在基因表达分析实验中可能是至关重要的；

非常适合于难以溶解的样品（例如，植物材料，丝状真菌和酵母）。

劣势：

根据使用的方法，多样本处理时比较耗时（例如，人工手动研磨处理）；

大量样品处理耗时，可能会增加样品降解的风险；

机械处理会在样本中产生热量，导致蛋白质聚集和核酸降解；l需要一些特殊工具或仪器。

方法二：酶裂解

添加一种酶来消化蛋白质或细胞结构，如酵母细胞壁和丝状真菌。

优势：

实验室中的理想方法，过程中无需机械裂解设备；

选择性的去除细胞壁，留下细胞部分采用另一种裂解方式（通常是化学裂解），方法灵活，避免了一些由机械裂解产生的破坏。

劣势：

耗时（酶消化可能需要1小时）而且价格昂贵；

由于酶诱导的细胞变化可能影响基因表达，因此不适合进行基因表达分析。

方法三：化学裂解

在化学分解过程中，细胞被一种能分解脂膜的洗涤剂清洗，从而释放细胞成分。除洗涤剂外，化学裂解缓冲液通常含有离液盐，如盐酸胍或尿素，这有助于破坏降解新暴露核酸蛋白质（如核酸酶）的稳定性，并使核酸与二氧化硅基质结合。化学裂解缓冲液的确切组成取决于应用方向和样品类型。

优势：

价格便宜，操作简单，速度快；无需专用设备。

劣势：

破坏细胞膜的洗涤剂通常也会溶解其他细胞膜，从而释放其成分。这种方法不适于细胞器特异性核酸的提取；

虽然这项技术对大肠杆菌有效，但对革兰氏阳性细菌、植物细胞或真菌细胞无效，因为存在阻止洗涤剂进入细胞膜的硬细胞壁；

在大肠杆菌样品中同时加入洗涤剂和离液盐可能会影响质粒DNA和基因组DNA的区别能力。但是，可以采取步骤区分这些类型，稍后讨论。

化学物质会给研究人员带来危险。

c. 核酸纯化原理的理解

在细胞裂解后，核酸被选择性的从周围细胞成分中释放出来，集中在水溶液或合适的缓冲溶液中以供下有使用。细胞理解后的步骤，统称为纯化。由于分离的核酸化学性质不变，无论样品类型如下，下面描述的纯化策略通常适用于所有样品类型。

①离心柱（Spin Columns）

该方法通常跟试剂盒紧密相关，离心柱提取和纯化可以快速获得高质量DNA、质粒、RNA和PCR产物，而无需进行新鲜试剂制备。离心柱含有硅胶或专有树脂的固体基质，用于选择性结合核酸。

典型离心柱提取操作步骤：

A.裂解的样本保留至离心柱：

裂解后的样品，收集在含有离液盐的结合缓冲液中，置于旋转柱。结合缓冲液允许核酸与水溶液分离并与柱基质结合。

B.核酸的结合：

离心使整个样品与柱基质接触。样本中的核酸选择性地与柱结合，而其他细胞组件通过（这通常称为流过）柱基质。

C.洗涤：

结合后，对柱子进行清洗，以去除可能严重影响下游应用的任何残留污染物，如蛋白质或残留盐类。清洗次数取决于试剂盒。一些洗涤缓冲液中含有离液盐以去除蛋白质，有些缓冲液中含有高浓度的乙醇以去除盐类。大多数试剂盒都几乎全部包括由乙醇组成的缓冲液作为清洗步骤，以确保完全除盐。

D.离心柱残留乙醇的去除：

清洗后，有时会进行短时间的空离心以去除残留乙醇。

E.洗脱：

从基质中洗脱核酸，加入少量的水或洗脱缓冲液*，柱子静置几分钟。自上一步，离液盐已经被去除，洗脱缓冲液能够使核酸再水化，使核酸与柱基质分离。一次离心可以将含有核酸样品的水溶液转移到新的离心管中。

*核酸通常储存在含有Tris和EDTA（TE缓冲液）的缓冲液中。EDTA的存在有助于抑制核酸酶活性。虽然TE缓冲液对抑制核酸酶是有效的，TE中EDTA的含量通常比大多数的Mg2+含量低几个数量级。

离心柱的优劣势：

优势：

低成本

高效可靠

产生核酸适用于用于下游应用

劣势：

生长缓慢的菌株核酸量低

洗脱不完全导致核酸流失

离心柱的结合能力决定了核酸的总量

质粒离心柱试剂盒

质粒提取试剂盒可以从大肠杆菌中快速分离质粒，是分子生物学实验室中应用广泛的试剂盒之一。

由于大肠杆菌易于化学裂解，质粒试剂盒将样品裂解和核酸纯化结合如下：

A.在细胞碎片被离心沉淀之前，细菌细胞在离心管中裂解；

B.裂解液的配置使得只有质粒DNA在裂解后可以跟离心柱结合。因此，细胞裂解液通过离心可以立即挂载到柱上。

C.将含有裂解物的质粒与离心柱结合，剩余的纯化步骤与所有其他离心柱方案相似。

D.水或TE缓冲液中洗脱使用高质量质粒DNA。

**大多数离心柱试剂盒在裂解过程中将质粒DNA与基因组DNA（gDNA）进行区分。裂解缓冲液中含有氢氧化钠和十二烷基硫酸钠，使质粒和gDNA完全变性。接下来的步骤，中和了样本，使质粒DNA重获新生。然而，高分子量的gDNA不能完全重新结合，并且容易与样品中的蛋白质缠结，从而阻止gDNA与离心柱结合，从而导致其去除。尽管在效率和可靠性上，质粒离心柱试剂盒存在一些缺点。试剂盒的优化标准主要是通过大肠杆菌菌株，生长缓慢或不稳定的菌株可能会发生低产量。此外，质粒试剂盒和离心柱试剂盒的结合能力有限，根据试剂盒的不同，总回收率在50到100μg之间。

其他离心柱试剂盒

除核酸提取外，离心柱还用于核酸的纯化和浓缩。纯化试剂盒，可用于移除PCR或其他酶制剂反应中未被发生反应的残留试剂，并从琼脂糖凝胶中纯化DNA。浓缩样品可以为许多下游应用提供更大的灵活性。

一些商业离心柱试剂盒具有片段筛选的功能，允许根据研究目的选择合适的筛选片段范围试剂盒（例如，小RNA）。这是通过改变缓冲溶液中的乙醇含量来实现的。

许多离心柱试剂盒结合了细胞裂解和核酸纯化，我们便可从几乎任何类型的样本中找到分离核酸的离心柱，包括但不限于昆虫、植物、种子、真菌、细菌、唾液、血液、粪便和石蜡包埋样品。

② 苯酚/氯仿和乙醇沉淀

苯酚/氯仿提取法是一种依靠溶解度不同原理分离核酸的方法。样品暴露于给定比例苯酚/氯仿混合液中获取所需的核酸。蛋白质可溶与苯酚/氯仿，核酸可溶于水。当苯酚/氯仿溶液与样品混合时，蛋白质和核酸被分离，为纯化提供保障。

对于RNA和DNA的双重提取，此过程可通过添加酸性苯酚进行调整。这使得过量的H+离子与磷酸盐骨架相互作用，导致DNA不带电。DNA将溶解在酚/氯仿萃取的酚层中，而RNA由于其天然的酸性，将保持溶解在水相中。离心后可以分离水相和有机相，并且每相都可以进行乙醇沉淀。

经典苯酚/氯仿和乙醇沉淀的操作步骤：

A.苯酚和氯仿的接触：

裂解的样品与苯酚/氯仿通常通过强旋涡混合。旋涡确保所有有机成分都能与苯酚/氯仿混合物充分相互作用，以达到完全溶解和去除的目的。

B.离心：A步骤后，可见两个相。含有核酸的水相位于顶部，而底部的有机相含有蛋白质、脂质和其他大分子。然后离心样品以完全分离这两个相

C.相分离：用移液管小心地除去水相。

D.乙醇沉淀：用乙醇沉淀、纯化核酸。在乙醇沉淀过程中，加入盐和乙醇以缓冲水溶液中的核酸。盐缓冲糖磷酸骨架，乙醇改变溶液的介电常数。这使得核酸能够从水溶液中分离出来，从而可以通过高速离心分离。

E.重悬：在水或TE缓冲液中重新溶解成团的DNA或RNA。

苯酚/氯仿提取的优、劣势：

优势：

效率高，通常比离心柱的产量高；ü适用于提取完整的高分子量DNA（如，gDNA）；

悬浮在复杂溶液中的样品通常仍适用于该方法，而一些挥发性化合物可干扰离心柱柱基质；

对于脂肪类型样品（如，脑组织），苯酚/氯仿提取优于大多数离心柱试剂盒。

劣势：

如果处理不当，苯酚和氯仿是有害的，必须在通风柜中极其小心地进行处理。

这种方法比离心柱试剂盒要费时，而且可能导致较低的得率。

核酸提取物中含有微量的苯酚和氯仿会对下游的酶反应产生负面影响，如，PCR。如果是这种情况，则需要在PCR之前清除。因此，有许多离心柱纯化试剂盒。

要有把握地提取不含污染物的水相，可能需要一点实践经验。

③提高通量的自动化方法

根据核酸的应用和样本类型的不同，可选择适合的高通量提取方法。最常用的是磁珠提取。在这项技术中，正电荷磁珠被引入到样品中，DNA在低pH下与带正电荷的磁珠结合，在高pH下释放DNA。珠子可以通过磁铁去除，溶液的pH可以很容易的调节，以分离所需核酸。这项技术快速高效，但在自动化设备上的投资可能会相当昂贵。（磁珠的包被材料不同，原理略有差异。）

d. 关键因子及对提取的影响

在进行核酸提取或纯化时，必须密切注意一些因素，如pH值、盐浓度、温度、缓冲体积和潜在的乙醇污染。这些因素中的每一个都会极大地影响下游实验的得率、质量和成功率。

1.非最适pH值或盐浓度可改变核酸的电荷，导致核酸不能与离心柱结合，或导致苯酚/氯仿错误的溶解核酸。

2.缓冲液体积不正确，可导致不完全裂解，中和或间接稀释洗脱的核酸。

3.乙醇污染可以抑制下游的酶反应，并使样品从琼脂糖凝胶中飘浮出来。

e. 特殊情况

1.高分子质量DNA的提取

对于某些应用（如，Southern杂交和一些测序过程），提取完整的高分子量（HMW）DNA是必要的。要提取HMWDNA，除了上述因素外，还需要考虑其他因素：

HMW-DNA在提取过程中容易断裂。因为剪切力（涡流、超声波等）可导致DNA分子的分解，从而在提取后产生较短的片段。为了避免这一点，对样本施加最小的剪切力。

对于需要对HMWDNA进行可视化的应用，可以在琼脂糖凝胶塞中进行裂解和提取，从而在整个过程中稳定DNA（例如，脉冲场凝胶电泳），其中整个染色体保持完整，并通过电泳显现。

碱裂解常常导致HMW-DNA的丢失，因为在变性过程中，HMW-DNA会发生不可逆的缠结。

如果使用离心柱提取HMW-DNA，考虑柱基质的结合容量大小。一些色谱柱只能处理10-15kb大小的片段，因为由于紧密结合，较大片段很难从色谱柱中洗脱。对于较大的碎片，可能需要考虑高HMW结合的专用柱，或手动方法，如苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀。

2.SmallRNAs

在传统的RNA提取过程中，小RNA分子经常丢失，因为传统的离心柱通常有大约100个碱基对的尺寸限制，尽管尺寸限制值很大程度上取决于缓冲液的配方。小RNA分子对于理解生物功能极其重要，所以大多数总RNA提取纯化试剂盒都经过优化以捕获这些小RNA。

二、评估提取的核酸

a. 定量与质控

在核酸提取和纯化之后，了解提取样品的浓度和质量是非常重要的。根据下游实验目的的不同，这些参数的波动会极大地改变结果。例如，如果每个cDNA合成反应不使用完全相同的总RNA，qRT-PCR的表达分析将导致不可靠的数据。有许多核酸评估方法，它们在时间消耗、成本和精度上有所不同。最终，选择方法时应考虑下游实验的要求。

以下是一些最常见的评估方法的概述：

1. 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳以分子量为基础，通过在电流的存在下通过固化的凝胶基质将核酸分离出来。将提取的核酸与平行的分子量标准进行比较，所述分子量标准包含已知大小和浓度的片段。

优势：目测DNA质量；完整的基因组DNA样本显示为完整条带；降解的核酸显示为弥散状态；核糖体RNA清晰可见；可供大多数实验室使用；可视化可能存在的污染（例如，质粒纯化样品中存在RNA）。

劣势：只提供粗略的浓度估计；不显示样品中存在污染物，如盐。

2. 毛细管电泳

毛细管电泳，有时被称为芯片上的实验室，通过一个由检测器监测的小毛细管来吸取样品，计算机接收信息并以图形方式显示。毛细管电泳适用于分析片段大小、数量和样品的整体质量。这种技术比传统的琼脂糖电泳更精确，通常是在qPCR之前进行核酸评估的方法。

优势：多类型核酸的精确分析；自动上样和定量比凝胶法更精确；高灵敏度-可检测和分析少、微量样品。

劣势：价格昂贵。

3. 分光光度法

分光光度法是一种快速检测技术，它依赖于光与样品相互作用的特性来精确定量。样品被装入通过测试的仪器（分光光度计）中不同波长的光通过它们，然后被探测器接收。探测器提供有关样品数量和质量的信息，然后计算机软件翻译。通过在260nm和280nm处测量吸光度，两者的比值表示样品的纯度。对于纯DNA和RNA，260/280的比率应该在1.8到2.1之间。可在230nm处进行额外测量，低于2.0的230/280nm比率表示存在有机污染物。

近年来，一种新型的基于荧光的分光光度分析方法在分子生物学实验室得到了广泛的应用。这种基于荧光的技术比传统的分光光度法具有更高的灵敏度，并且能够通过使用DNA和RNA特有的荧光染料来区分DNA和RNA。

优势：准确快速；提供关于污染物存在的信息；大多数实验室都有分光光度计。

劣势：无法量化单个片段；昂贵。

b.提高核酸质量

尽管我们尽了很大的努力，但通常还是有必要采取额外的措施来提高核酸质量。以下将描述在需要改进核酸质量时需要考虑的一些附加因素。

1.使用和储存温度：

核酸易被核酸酶（即RNase和DNase）降解，低温储存有助于抑制酶活性。DNA天生比RNA更稳定，在较高的储存温度下对核酸酶活性更具抵抗力。

DNA应储存在-20℃或以下，并在使用过程中保存在冰上。反复的冻融可能会使DNA片段化，特别是HMW-DNA。因此，如果经常使用HMWDNA，则应将其储存在4℃下。

RNA更易被核酸酶降解，应始终保存在非常低的温度（-20至-80℃），只有在必要时才能解冻。

2. 核酸酶抑制剂和清洗液

核酸酶的存在可以快速降解核酸样品。很容易将核酸酶从未受保护的手转移到工作表面；因此，在使用核酸时应始终戴手套。

工作场所应保持清洁，并经常用乙醇擦拭，以去除核酸酶污染。有许多商用产品可以防止RNase污染。许多研究人员还将核糖核酸酶抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC）添加到水中，用于RNA的工作。在RNA工作之前用EDPC清洗和处理玻璃器皿也是可取的。

近年来，市场上出现了许多核酸稳定剂。与上述清洗溶液不同，这些试剂在采集点直接添加到完整样品中，以抑制核酸酶并稳定核酸，直到进行提取。尽管这些试剂中的大多数与大多数下游提取试剂盒和应用兼容，但其中一些试剂需要在提取核酸之前从完整样品中去除。

3. 使用无核酸酶耗材

使用任何核酸时，确保对任何消耗品或玻璃器皿进行核酸酶处理。尽可能购买无核酸酶管和带过滤器的吸管头。如果在分析之后，您发现您的DNA产量很低，质量不理想，或者如果提取的DNA通过了您的质量评估，但您在下游实验过程中获得了不理想的结果，则需要进行一些故障排除。

文章来源于知乎。