边合成边测序——NGS测序原理

       NGS是将DNA随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中数以万计的克隆进行延伸反应，检测对应的信号，最终获取序列信息。

NGS的核心原理是边合成边测序，如下图分析：

目前市场运用比较广泛的是Illumina公司，将构建好的文库通过碱基互补配对原则连接到专用的芯片Flowcell上，步骤如下：

一、Flowcell 8条通道，内表面→化学修饰→2种dna引物→与待测序DNA文库的接头序列相互补→通过共价键连到Flowcell上防止被液体冲掉

二、Dna文库：许多个DNA片段，在两头接上了特定的dna接头形成的DNA混合物→两个特点，制作方法→超声波打断基因组DNA，两头用酶补平，用Klenow酶在3'端加上一个A碱基，再用连接酶连接接头→形成文库→DNA混合物

三、桥式pcr：把文库种到芯片上去→互补杂交（文库两头的DNA序列与芯片引物互补）→加入dntp和酶→产生新链→加NaOH碱溶液→DNA链解链→留下原链→加入中性液体中和碱液→DNA上的另外一端与玻璃板上的第二种引物互补杂交→加入酶和dntp→加碱→加中和液体→重复过程进行扩增

四、把合成的双链变成可以测序的单链→化学反应→切断一个引物上的特定基团→碱溶液洗芯片剩下一个链→加中性溶液与测序引物（带荧光标记的dntp→3'末端被一个叠氮基堵住→一个循环只能延长一个碱基，聚合酶→选择与原来位置上碱基互补的dntp）→用水把多余的dntp和酶冲掉→放到显微镜下进行激光扫描→根据发出来的荧光判断碱基类型（4种dntp）→加入化学试剂切掉叠氮基团和旁边标记的荧光集团→暴露3'端羟基→加入新的dntp和新酶→再次延长一个碱基→冲掉多余的酶和dntp→在激光扫描读颜色→重复此过程

五、index：在文库的接头上做标记，样本特定接头上的特定序列标记了样本的来源

六、读index：碱解链read1DNA→加入中性液→加入read2测序引物（结合位点正好在index序列旁边）→进行2轮测序（一般为6到8个碱基）→了解某一个具体的一段DNA来自于原始的哪个样本

七、双端测序：一根DNA链正反向各读一遍，增加一倍测序的有效长度

八、倒链：合成DNA互补链→用化学试剂切原链的根→剩下互补链→进行第二段测序（加read3引物读碱基）