浏览数量: 0 作者: 本站编辑 发布时间: 2022-05-12 来源: 本站
核酸纯化在分子生物学实验室已经广泛应用。怎样获得高质量、高纯度的DNA或RNA样品对下游实验的顺利进行至关重要,因此,对纯化后的核酸进行鉴定也是必不可少的步骤。
琴篇-纯度评估
分光光度法
原理:由于核酸中的碱基都具有共轭双键,所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线,其吸收高峰在260nm处,吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处,所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一,相当于琴谱中的宫、商、角、徵、羽。
选择正确的稀释倍数:确保OD260值在0.1-1.0之间
DNA Yield=OD260*稀释倍数50ng/μl,RNA Yield=OD260稀释倍数*40ng/μl
DNA纯度
OD260/OD280=1.7-1.9,OD260/OD230=2.0左右,说明纯度很好;
DNA纯度问题:
OD260/OD280<1.7说明有蛋白质污染;
OD260/OD280>1.9说明有部分降解或有RNA污染。
OD260/OD230<2.0,表明有盐离子、有机大分子残留。
RNA纯度
OD260/OD280=1.9-2.1,OD260/OD230=2.0左右说明纯度很好。
RNA纯度问题:
OD260/OD280<1.9表明有蛋白质或基因组的残留;
OD260/OD280>2.1表明RNA有部分降解。
OD260/OD230<2.0,表明有盐离子、大分子残留。
瑟篇-浓度检测
对于核酸浓度检测有多种检测方法,本篇文章主要介绍荧光光度法。
原理:荧光光度法以核酸染料嵌入碱基平面后,使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙色荧光,且荧光强度积分与核酸含量成正比。最终实现以标准曲线为瑟弦由荧光强度来奏曲。
琵琶篇-核酸完整性评估
琼脂糖凝胶电泳是用于核酸提取后产物完整性评估的传统方法,针对基因组DNA会得到清晰的单一的完整性条带;高质量的总RNA电泳后有清晰的28s、18s、5s条带。以“大珠小珠落玉盘的形象”展示出各自的视觉音阶。
基因组DNA电泳图
总RNA电泳图
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